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高特异性高亲和力的链霉亲和素-生物素结合：已固定或培养细胞的抗原与一抗形成抗原抗体复合物，生物素化二抗特异性结合上述复合物，经辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素特异性识别生物素(即抗原所在位置)，最后经辣根过氧化物酶底物显色即可检测相应抗原。

• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• DAB是一潜在致癌物，使用时请注意自我防护。
  
• 检测样本时需同时做阴性对照和阳性对照。
  
• 本制品仅作科研用途！

• 脱蜡水化：将石蜡切片置于新鲜二甲苯中浸泡15min，重复三次。去除多余的液体后，依次置于无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，各浸泡5min，蒸馏水(或自来水)冲洗5min。用PBS缓冲液(将干粉溶解于2L去离子水中)冲洗切片5min，重复三次。
  
• 抗原修复：将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯(或修复盒)中的耐高温塑料切片架上，加适量修复液1×柠檬酸钠抗原修复液(将100×柠檬酸钠抗原修复液加去离子水稀释成1×柠檬酸钠抗原修复液)，液面要浸过切片组织一定高度，将修复盒置于沸水中煮沸修复15min后取出玻片，自然凉至室温。用PBS缓冲液冲洗切片5min，重复三次。
  
  • 抗原修复时，修复液务必保证切片始终浸泡在液体内，一般情况修复液的量约为800mL/1架。
• 阻断内源性过氧化物酶：用吸水纸擦干玻片，免疫组化笔在组织周围画圈，滴加50μL内源性过氧化物酶阻断剂到切片组织上以阻断内源性过氧化物酶，室温孵育30min，用PBS缓冲液冲洗切片5min，重复三次。
  
• 血清封闭：用吸水纸擦干玻片，滴加50μL封闭用正常山羊血清工作液，37℃封闭20min，以减少非特异性染色。
  
• 一抗孵育：用抗体稀释液将一抗原液稀释成工作液，用吸水纸擦干玻片组织周围的液体，滴加适量抗体工作液，置于孵育盒4℃孵育过夜或37℃孵育1～2h。
  
• 复温：4℃过夜后从冰箱拿出样本，在室温下孵育15min复温(抗体孵育为4℃过夜选用此步骤，如室温孵育直接进入下一步清洗)。用PBS缓冲液冲洗切片5min，重复三次。
  
• 二抗孵育：吸水纸擦干切片后滴加50μL生物素标记羊抗小鼠IgG，37℃孵育20min，用PBS缓冲液冲洗切片5min，重复三次。
  
• 三抗孵育：吸水纸擦干切片后滴加50μL辣根酶标记链酶卵白素工作液孵育，37℃孵育20min，用PBS缓冲液冲洗切片5min，重复三次。
  
• 显色：甩去PBS缓冲液，吸水纸擦干切片；每张切片滴加新鲜配制的DAB工作液50μL(20×DAB显色液∶20×DAB稀释液∶PBS缓冲液=1:1:18比例配置)，孵育3～5min，光学显微镜下观察染色结果，切勿显色过深；显色后用自来水冲洗切片终止显色。
  
  • DAB显色液需现配现用，避光放置，且在30min内使用。
    
  • 可根据需要一次染多张切片，各种试剂量按照上述比例放大即可。
• 复染：滴加适量苏木素染液复染，孵育1～5min，自来水冲洗5min，滴加盐酸酒精分化液分化30sec，自来水冲洗。
  
• 脱水封片：将玻片依次置于70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇，各浸泡5min，再将玻片放入二甲苯中浸泡15min，重复三次。玻片取出来稍晾干，用中性树胶封片。
  
• 结果判定：在光学显微镜下对染色的切片观察并判断。苏木素染细胞核为蓝色，DAB显色的阳性表达为棕黄色。